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            晚期非小細胞肺癌組織中BRCA1、RAP80的表達與化療療效的關系

            【】2015-07-23 點擊次數
            基金項目:廣東省科技計劃項目(編號:粵科規劃字[2012] 145號)
            張賢蘭 黎少琴 蘇 寧 薛麗京 劉 燕:廣州市胸科醫院 廣東廣州 510095

            晚期非小細胞肺癌組織中BRCA1、RAP80的表達與化療療效的關系

            張賢蘭 黎少琴 蘇 寧 薛麗京 劉 燕
            BRCA1 AND RAP80 EXPRESSIONS IN STAGE Ⅲ-IV NON-SMALL CELL LUNG CANCER AND THEIR RELATIONSHIP WITH CHEMOTHERAPY EFFECTS
            ZHANG Xianlan, LI Shaoqin, SU Ning, et al


              【摘 要】 目的 研究人類乳腺癌易感基因(BRCA1)及受體相關蛋白80(RAP80)在晚期非小細胞肺癌(NSCLC)中的表達及其與化療療效的關系。方法 應用免疫組織化學(IHC)方法檢測62例經病理確診為晚期NSCLC患者石蠟切片標本中BRCA1及RAP80蛋白表達的情況,分析其與吉西他濱聯合順鉑(GP)方案化療療效的關系,同時分析BRCA1 與RAP80 表達水平的相關性。結果 BRCA1及RAP80蛋白表達在不同年齡、性別、吸煙史、PS評分、病理類型、TNM分期組中無明顯差異;BRCA1和RAP80蛋白表達陰性組GP方案化療有效率高于蛋白表達陽性組,兩組比較差異有統計學意義(p<0.05);BRCA1與RAP80的表達呈正相關(γ=0.625, p<0.01)。結論 BRCA1及RAP80蛋白表達陽性與鉑類耐藥有關; BRCA1與RAP80的表達呈正相關,提示BRCA1通過RAP80參與DNA修復。
              【關鍵詞】 乳腺癌易感基因1,受體相關蛋白80,非小細胞肺癌

              【Abstract】 Objective To analyze associations of gemcitabine-platinum chemotherapy effects with BRCA1 and RAP80 expressions in Ⅲ-IV non-small cell lung cancer (NSCLC). Methods The immunohistochemical method was used to detect expression of BRCA1 and RAP80 in 62 patients with Ⅲ-IV NSCLC.Chi‐square test was used to evaluate the association of chemotherapeutic effect with BRCA1 and RAP80 expressions. Spearman relationship was conducted to evaluate the associations among expression of BRCA1 and RAP80. Results In these 62 cases, positive expression of BRCA1 and RAP80 had no correlation with age, gender, smoking, PS score, pathology and clinical stage. The patients with negative BRCA1 and RAP80 expression in Ⅲ-IV NSCLC were more sensitive to gemcitabine-platinum chemotherapy compared with patients with positive BRCA1 and RAP80 expression. There were statistical differences (p<0.05);The expression levels of BRCA1 and RAP80 were positive correlated (r=0625, p<0.01). Conclusion Positive BRCA1 and RAP80 expression are correlation with platinum resistance; The expression of BRCA1 and RAP80 were positive correlated, which showed that BRCA1 repaired DNA through RAP80 participation.
                 【Key words】  Breast cancer susceptibility gene 1(BRCA1), Receptor-associated protein 80(RAP80), Non-small cell lung cancer
                 【Author′s address】 Guangzhou chest hospital, Guangzhou, 510095, china
              doi:10.3969/j.issn.1671-332X.2015.06.005

              晚期肺癌患者診斷時即失去手術等根治的機會,治療方式以全身姑息治療為主,亦即以化學藥物治療和分子靶向藥物治療為主。隨著基礎研究及臨床研究的一系列進展,肺癌個體化治療的觀念逐漸深入臨床,目前晚期NSCLC患者一線標準的化療方案為含鉑的兩藥方案,中位OS在7~9個月左右,1年生存率在30%~40%,但是臨床實踐中觀察到不同患者之間的療效相差較大。本研究擬選取晚期NSCLC患者,獲得癌組織后檢測BRCA1及RAP80蛋白表達水平,分析一線化療療效與BRCA1及RAP80蛋白表達的相關性?,F報道如下。
                 1 資料與方法
            1.1 臨床資料
                 收集廣州市胸科醫院2012~2014年經組織病理診斷為III~IV期NSCLC的石蠟包埋組織標本62例,其中男性54例(871%),女性8例(129%),中位年齡41~74歲,病理鱗癌18例(29%),腺癌42例(677%),大細胞癌2例(32%),按照AJCC分期第六版進行分期,IIIA期33例(532%),IIIb期17例(274%),IV期12例(193%)。
            1.2 治療方法
                 采用GP方案:吉西他濱1 250 mg/m2,靜脈滴注,第l天、第8天;順鉑75 mg/m2,第l天至第3天靜脈滴注。所有的方案每3周重復1次,共4個療程。第2個療程和第4個療程結束后復查CT以進行療效評價。4個療程化療結束后進行隨訪。所有患者每2~3個月隨訪一次。
            1.3 療效評價標準
                 按RECIST方法實體瘤客觀療效評價標準判斷化療療效。完全緩解(CR):治療后病灶完全消失,且持續≥4周無新病灶出現;部分緩解(PR):病灶縮小≥30%,且持續≥4周無新病灶出現;穩定(SD):病灶無明顯變化,包括病灶縮小不到30%或增大≤20%;進展(PD):病灶增大≥20%或出現新病灶。CR+PR為有效,SD+PD為無效。
            1.4 免疫組織化學
                 組織標本均經10%甲醛固定,常規石蠟包埋,5 um連續切片,常規脫蠟水化后進行預處理,以3%的H202,去離子水孵育10 min,阻斷內源性過氧化物酶,蒸餾水洗3次,每次2 min;分別滴加兔抗人BRCA1單克隆抗體(1∶ 100稀釋)和兔抗人RAP80單克隆抗體(1∶ 100稀釋),室溫孵育1~2 h,蒸餾水洗3次,每次2 min;滴加二抗工作液,37℃孵育20~30 min,蒸餾水洗3次,每次2 min;滴加三抗工作液,37℃孵育20~30 min,蒸餾水洗3次,每次2 min;DAB顯色5 min,自來水充分沖洗;蘇木精復染,脫水,二甲苯透明,中性樹脂封片,編號。
            1.5 免疫組化結果判斷標準
                 BRCA1陽性表達主要位于細胞漿,為棕黃色顆粒。RAP80陽性表達主要位于細胞核,為棕黃色顆粒。免疫組化的結果判斷由2位病理科醫師(其中一位為主任醫師),在不知道患者臨床資料的情況下,對標本染色結果進行判斷。高陪鏡下(400×),隨機統計1 000個腫瘤細胞中的陽性細胞數,計算陽性細胞百分率。參照WACHTERS等[1]方法來判斷BRCA1、RAP80的表達,陰性表達(-):不表達或陽性細胞數≤10%;陽性表達(+):陽性細胞>10%。
            1.6 統計學處理
                 應用SPSS 13.0軟件對各組數據統計分析,計數資料的分析采用2檢驗,相關性分析采用Spearman雙變量相關分析,p<005表示有統計學意義。
                 2 結果
            2.1 BRCA1和RAP80蛋白表達
                 在NSCLC組織中BRCA1蛋白表達定位于腫瘤細胞漿內,陽性染色者在細胞漿內有棕黃色顆粒沉著(圖1),染色結果顯示BRCA1蛋白陽性表達者37例,BRCA1蛋白陰性表達者為25例,陽性表達率是596%(37/62); RAP80蛋白表達定位于腫瘤細胞核內,陽性染色者在細胞核內有棕黃色顆粒沉著(圖2),染色結果顯示RAP80蛋白陽性表達者35例,陰性表達者為27例,陽性表達率是564%(35/62)。


            2.2 BRCA1和RAP80蛋白表達和患者臨床特征之間的關系
                 BRCA1蛋白表達在不同年齡、性別、吸煙史、PS評分、病理類型、TNM分期組之間比較均無統計學差異(p>0.05)。 見表1。

            表1 BRCA1和RAP80蛋白表達與臨床特征的關系

            n(%)

            臨床特征 BRCA1(+) BRCA1(-) p RAP80(+) RAP80(-) p
            年齡(年)     0.253     0.832
             >60(25) 15(60.0) 10(40.0)   14(56.0) 11(44.0)  
             ≤60(37) 22(59.4) 15(40.6)   21(56.7) 16(43.3)  
            性別     0.056     0.345
             男(54) 32(59.2) 22(40.8)   30(55.6) 24(44.4)
             女(8) 5(62.5) 3(37.5)   5(62.5) 3(37.5)  
            吸煙史     0.325     0.632
             吸煙(37) 22(59.4) 15(40.6)   21(56.7) 16(43.3)  
             不吸煙(25) 15(60.0) 10(40.0)   14(56.0) 11(44.0)
            PS評分     0.075     0.066
             0+1(56) 33(58.9) 23(41.1)   31(55.3) 25(44.7)  
             2(6) 4(66.6) 2(33.4)   4(66.6) 2(33.4)  
            病理類型     0.412     0.124
             腺癌(42) 25(59.5) 17(40.5)   23(54.7) 19(45.3)  
             鱗癌+大細胞癌(20) 12(60.0) 8(40.0)   12(60.0) 8(40.0)  
            TNM分期     0.086     0.254
             Ⅲ(50) 30(60.0) 20(40.0)   28(56.0) 22(44.0)  
             Ⅳ(12) 7(58.3) 5(41.7)   7(58.3) 5(41.7)  

            2.3 BRCA1蛋白表達與化療療效之間的關系
                 62例患者接受GP方案化療后ORR為33.87%(21/62)。BRCA1蛋白陰性組化療后ORR為520%(13/25),BRCA1蛋白陽性表達組化療后ORR為21.6%(8/29),兩組比較差異有統計學意義(p<0.05)。見表2。提示BRCA1蛋白陰性組含鉑藥物化療療效優于陽性組。

            表2 BRCA1表達與化療療效的關系

            (n,%)

            組別 例數 有效
            (CR+PR)
            無效
            (SD+PD)
            有效率
            (ORR)
            BRCA1陽性組 37 8 29 21.6
            BRCA1陰性組 25 13 12 52.0
            合計 62 21 41 33.87

            2.4 RAP80蛋白表達與化療療效之間的關系
                 RAP80蛋白表達陰性組化療后ORR為44.4%(12/27),RAP80蛋白陽性表達組化療后ORR為28.6%(10/35),兩組比較差異有統計學意義(p<0.05),見表3, 提示RAP80蛋白陰性組含鉑藥物化療療效優于陽性組。

            表3 RAP80表達與化療療效的關系

            (n,%)

            組別 例數 有效
            (CR+PR)
            無效
            (SD+PD)
            有效率
            (ORR)
            RAP80陽性組 35 10 25 28.6
            RAP80陰性組 27 12 15 44.4
            合計 62 21 41 35.48

            2.5 BRCA1和RAP80蛋白表達的相關性
                 BRCA1和RAP80蛋白同時高表達的患者有15例,同時低表達的18例,BRCA1高表達而RAP80低表達的有14例,BRCA1低表達而RAP80高表達的共15例,兩者的表達水平呈正相關(γ=0.625, p<0.01)。
                 3 討論
                 化療相關分子標志物的研究近年來進展迅速。其中BRCA1是一個有潛在研究價值的指標。BRCA1是第一個被發現的家族性乳腺癌易感基因,該基因定位于人染色體17q21,全長約100 kb,編碼1 863個氨基酸及其對應的220 kD的核磷蛋白。BRCA1主要通過DNA修復、mRNA轉錄、細胞周期的調節以及蛋白泛素化等途徑參與細胞的各種應答反應。由于大多數化療藥物均通過直接或者間接的DNA損傷來發揮抗腫瘤作用,所以BRCA1在化療藥物所導致的DNA損傷及其對這些藥物療效預測方面的價值得到了廣泛的關注。
                 基礎研究顯示,與親代細胞相比,順鉑耐藥細胞系的BRCA1表達水平明顯提高。通過干擾抑制BRCA1的表達可使細胞對順鉑的敏感性明顯增強[2]。2004年西班牙肺癌協作組(SLCG)報道在接受CDDP/GEM新輔助化療的NSCLC患者中,BRCA1低表達患者中位生存時間尚未觀察到,中表達患者中位生存時間為37.8個月,而高表達患者中位生存時間僅為12.7個月[3]。而BRCA1及RAP80均低表達的患者TTP高達14個月,遠遠超過所有常規化療晚期肺癌的TTP(均不超過7個月)[4]。本研究結果也提示BRCA1及RAP80均低表達的患者化療療效較高表達者好。BRCA1表達陰性者的GP方案化療有效率(520%)高于陽性者(21.6%)(p<0.05), RAP80蛋白表達陰性患者GP方案化療有效率達44.4%,而陽性表達患者有效率只有28.6%,提示BRCA1和RAP80蛋白表達陽性的NSCLC患者對鉑類耐藥,同時發現BRCA1和RAP80的表達與患者性別、年齡、臨床分期、吸煙指數以及病理類型無關,這與魯小敏等[5]的研究一致。
                 2007年Science雜志發表的研究證實BRCA1通過RAP80參與DNA修復,后者在DNA損傷途徑修復中發揮關鍵作用。RAP80與聚集在DNA損傷微點的特定類型泛素結合,將BRCA1靶定位到DNA斷裂位點,從而使得BRCA1復合物能夠到達損傷位點,在正常的DNA損傷修復反應中起關鍵作用。另外,RAP80還能特異性地與BRCA1一起在細胞周期的G2/M檢控位點處起作用[6-8]。ROSELL等研究發現BRCA1表達水平與患者的無病生存時間DFS相關:基因表達水平高的患者DFS短,預后較差[9]。JOERGER等分析了GP方案化療后晚期肺癌患者組織中BRCA1、ERCC1、RAP80等指標的表達,發現在所有BRCA1表達的患者中,RAP80與中位OS顯著相關,RAP80是預測BRCA1表達肺癌患者OS的顯著指標[10]。 本研究顯示BRCA1和RAP80蛋白同時高表達的患者有15例,同時低表達的18例,兩者的表達水平呈正相關(γ=0.625, p<0.01),顯示瘤內BRCA1高表達者同時也伴有RAP80高表達,提示BRCA1通過RAP80參與DNA修復,與徐露娟等[11]研究觀察到進展期NSCLC癌組織中BRCA1 mRNA與RAP80 mRNA的表達呈正相關一致。
                 綜上述研究提示晚期NSCLC 癌組織中BRCA1和RAP80的蛋白表達與化療療效相關, BRCA1通過RAP80參與DNA修復,研究BRCA1及RAP80在晚期NSCLC中化療療效的預測作用,為后續開展可能的前瞻性研究提供參考數據。BRCA1和RAP80的蛋白表達水平目前已成為NSCLC個體化化療的重要分子標記和預后指標,本研究后續需進一步隨訪生存期及擴大樣本量以證實BRCA1及RAP80在NSCLC預后中的指導作用。

            參考文獻
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            [2] SYLVAIN V, LAFARGE S, BIGNON YJ. Dominant-negative activity of a BRCA1 truncation mutant: effects on proliferation, tumorigenicity in vivo, and chemosensitivity in a mouse ovarian cancer cell line[J]. Int J Oncol, 2002, 20:845-853.
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            (下轉第16頁)(上接第13頁)
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            [11] 徐露娟,魏 嘉,禹立霞,等. 進展期非小細胞肺癌BRCA1mRNA和RAP80mRNA表達水平與臨床病理特征的關系[J]. 中國癌癥雜志,2011(11):821-827.

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