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            綜合因素對腸易激綜合征動物模型造模的影響

            【】2015-05-19 點擊次數
            基金項目: 國家自然科學基金項目(編號:81073160);廣東省自然科學基金項目(編號:S2012010010539) 
            閆 雪 唐洪梅 張慶業 李得堂 何嘉侖 廖小紅 :廣州中醫藥大學第一附屬醫院 廣東廣州 510405 

            綜合因素對腸易激綜合征動物模型造模的影響

            閆 雪 唐洪梅 張慶業 李得堂 何嘉侖 廖小紅
            A COMBINATION OF FACTORS INFLUENCE ON IRRITABLE BOWEL SYNDROME ANIMAL MODEL OF MODELIN 
            YAN Xue, TANG Hongmei, ZHANG Qingye, et al 


              【摘 要】 目的  建立腸易激綜合征綜合因素動物模型,并與單因素模型比較。方法  將SD大鼠分為母嬰分離組、腸道化學刺激組、束縛刺激組、綜合因素組、空白組,五組動物分別進行一般狀況及大鼠體重測試、排大便情況評估、直腸敏感性測試、腸道推進測試,并進行常規HE染色及5-HT檢查。結果  在一般狀況及大鼠體重測試中束縛組、母分組IBS模型大鼠體重有略微下降,其中醋酸組與綜合因素組的體重明顯低于空白組,綜合因素組與母分組的活躍程度低,束縛組與醋酸組的活躍程度稍低;在排大便情況評估中各因素組與空白組比較均有顯著性差異(p<0.05),其中束縛組的糞便點數最高為5.7±1.3,醋酸組、綜合因素組其次分別為5.0±3.0、4.0±1.0,母嬰分離組的影響最小為3.3±0.7;與空白組的腹部回縮反射(AWR)測試比較綜合因素組(72±10)、母分組(69±3)、醋酸組(67±12)、束縛組(64±6)均有顯著性差異(p<0.05);腸道推進測試中各因素組與空白組的腸墨汁推進率比較均有顯著性差異(p<0.05),綜合因素組的推進率最高達到72.56%,束縛組、母分組、醋酸組分別為67.97%、67.27%、56.25%;HE染色檢查結果顯示,各組別IBS大鼠模型的的局部組織均無明顯的炎性浸潤;5-HT檢查表明各因素組與空白組的5-HT陽性指標比較均有顯著性差異(p<005),綜合因素組的5-HT(結腸0.5、直腸0.8)雖然也較空白組(結腸0.1、直腸0.2)有明顯增加,但是僅稍優于母分組(結腸0.2、直腸0.4),明顯低于束縛組(結腸1.1、直腸1.6)和醋酸組(結腸1.2、直腸1.7)。結論 綜合因素大鼠造模成功,與各單因素動物模型比較綜合因素組并沒有表現出明顯的差異,而綜合因素組更加貼近腸易激綜合征臨床上多病因、發病機制復雜的情況,在此方面大大優于單因素動物模型。 
              【關鍵詞】 IBS 動物模型 綜合因素 
              doi:10.3969/j.issn.1671-332X.2015.04.006 

              腸易激綜合征(Irritable Bowel Syndrome,IBS)是一種原因不明的以腹痛或不適及大便習慣改變為特征的慢性腸功能紊亂性疾?。?]。由于疾病的上述特點,造成IBS動物模型研制困難。至今沒有有效治療IBS的中成藥批準上市,主要是因為缺乏穩定可控的動物模型基礎平臺。本實驗建立一個綜合因素IBS模型,并通過與現行單因素IBS模型作比較,探討是否優于現行的模型及其影響。以母乳分離、腸道刺激、束縛刺激為造模的單因素,將三者結合,制定出綜合因素模型組,將綜合因素動物模型與單因素IBS模型進行比較,分析該造模方法的優缺點。
            1 儀器與試藥
            1.1 動物
                 出生少于2天的SD大鼠4窩,SPF級(購自廣東省醫學實驗動物中心,合格證號:2008A010) 
            1.2 藥物及試劑
                 石蠟油:泰興科學儀器經營部,批號:20080604-2;醋酸:廣州化學試劑廠,批號:20080202-2;乙醚:廣州化學試劑廠,批號:20071205-1;實驗試劑10%緩沖甲醛:40%甲醛10 ml,0.01 mol/L的PH7.4的PBS90ml,蘇木素,伊紅。
            1.3 儀器
                 血壓計(型號:GB3053-93)電子分析天平(型號:BP211D) ;Leica脫水機、包埋機、切片機、染色機。
            2 動物分組與造模方法
                 出生少于2天的SD大鼠5窩,每窩作為一組,每窩8只乳鼠與其母鼠一同飼養,第25天雄鼠和雌鼠分籠飼養,母鼠單獨飼養,到第6周再開始測試指標。
            2.1 母嬰分離組[2] 從出生第2天開始到第21天(上午),每天母嬰分離180 min,乳鼠單獨置于一個籠,第22天起正常飼養,到第6周再開始測試。
            2.2 腸道化學刺激組[3-4] 實驗幼鼠(n=10)從第8~21天,將幼鼠用乙醚麻醉后,用自制的直腸刺激注射裝置經石蠟油潤滑后輕柔地插入肛門,在8~14天時插入約2 cm,在15~21天時插入約3 cm,每次插入穩定后,在幼鼠第8~14天注入1%的醋酸0.2 ml/次/天,第15~21天時注入1%的醋酸0.4 ml/次/天,注入醋酸后,注射管在腸內停留1~2 min,以免醋酸流出。
            2.3 束縛刺激組[5-6] 第8~21天的大鼠(下午)腹腔注射30%水合氯醛(3 ml/kg)麻醉,用紙帶束縛前肩、前上肢及胸部,限制其搔抓頭面部,但不控制其活動。自大鼠清醒后開始計時,束縛時間為2 h,每天1次,持續14 d。造模結束后2周內不進行任何操作,2周后再開始測試。
            2.4 綜合因素組 實驗幼鼠(n=10)從出生第2天開始到第21天,每天按第2點方法進行母嬰分離180 min。從第8天到21天,從第8天到第21天幼鼠母嬰分離后放回母鼠同籠進行哺養至少3 h,按第3點方法進行醋酸刺激一次,再放回與母鼠同籠哺養至少1 h,然后按第4點方法進行束縛刺激2 h一次。
            2.5 空白組 從第2~24天,母乳同籠正常飼養,第25天開始,母鼠和小鼠分離。
            3 指標測試及結果
            3.1 一般狀況及大鼠體重測試 比較IBS幼鼠與正常幼鼠的毛發狀況、飲食、睡眠、活躍程度等一般情況,母分組和綜合因素組與空白組對比,大鼠活躍程度低,其他組與空白組對比活躍程度稍低。 
                 在第35天、第49天、第63天鼠齡測試數據表明(見表1),IBS幼鼠和同齡空白幼鼠比較中,束縛組、母分組IBS模型大鼠體重有略微下降,其中醋酸組與綜合因素組的體重明顯低于空白組,表明多因素造模的大鼠生活質量變化較大,大鼠體重的降低較多。這與IBS患者生活質量下降,體重減輕的癥狀相符[7]。 

            表1 五組大鼠三鼠齡測試平均體重評價

            (g) 


            分組
            體重
              第35天 第49天 第63天 活躍程度
            空白組 191 198 265 +++  
            束縛組 166 192 215 ++  
            醋酸組 149 193 215 ++  
            母分組 164 153 205 +  
            綜合因素組 106 143 196 +  
             注:“+”表示活躍程度低,“+ +” 表示活躍程度稍低,“+ + +”表示活躍 
            3.2 排大便情況評估 各組大鼠分別于造模結束后第14天,在籠內墊清潔濾紙,觀察4 h內大鼠排便的糞點數。實驗均在白天進行,從第6周開始每周測定一次,連續測定4周。見表2。 
              表2 五組大鼠三鼠齡測試糞便改變評價

            (±s,n=8) 

            分組 糞便點
            空白組 1.3±0.7
            束縛組 5.7±1.31)
            醋酸組 5.0±3.01)
            母分組 3.3±0.71)
            綜合因素組 4.0±1.01)
             注:與空白組比較:1)表示p<0.05有顯著性差異 
              空白組大鼠糞質多為柔軟的香腸狀,各IBS模型組出現有軟的團塊或濕潤的糞便。實驗表明,從第35天鼠齡到63天鼠齡的測試表明,在跨度1個月的時間內,五組模型大鼠均表現有輕度腹瀉的癥狀,證明各IBS模型組大鼠均有慢性腹瀉。
                 在本實驗的各單因素動物模型組中,束縛組的腹瀉癥狀最為明顯,考慮應激刺激因素對此腹瀉的影響最大,腸道化學刺激其次,精神因素的影響最小。綜合因素組的糞便點數增加并非最多,少于醋酸組與束縛組。
            3.3 直腸敏感性測試 在幼鼠鼠齡的第63天對各組幼鼠進行大鼠的腹部回縮反射(AWR)測試,將血壓計、針管與自制指套氣囊用三通管連接,用針管向氣囊內打氣時可以在血壓計上讀出氣囊內壓力。大鼠在自制的密封麻醉瓶進行乙醚麻醉后,把用石蠟油潤滑后的氣囊經肛門輕柔地插入約3~5 cm,氣囊末端距肛門1 cm,用膠布把導管和大鼠尾巴根部纏在一起,固定氣囊。大鼠蘇醒后,將其放在特制的不能轉身的透明塑料瓶內。5 min后待大鼠適應環境,在大鼠意識完全清醒的情況下逐漸打氣擴張腸道,分別觀察引起大鼠腹部抬起以及背部拱起的壓力閾值。結果見表3。 
                表3 五組大鼠測試AWR閾值評價

            (±s,n=8) 

            組別 平均壓力(mmHg)
            空白組 77±5
            束縛組  64±61)
            醋酸組   67±121)
            母分組   69±31)
            綜合因素組   72±101)
             注:與空白組比較:1)表示p<0.05有顯著性差異 
              考慮不同人員對大鼠腹部抬起、背部拱起的判斷標準不同,所以本實驗中各組的評估由同一名人員進行。注氣后,達到腹部抬起、背部拱起的的氣囊擴張壓力閾值各組間有顯著差異,但本項測試中,綜合因素的AWR閾值并不低于各單因素組的AWR閾值,說明本實驗中的綜合因素動物模型的腸道敏感性低于各單因素組動物模型。
            3.4 腸道推進測試  胃腸道推進是評價胃腸動力和致瀉、止瀉作用的重要參數,用墨汁灌胃后一定時間內取出。在第70天鼠齡,模型大鼠禁食(不禁水)1天后,用5 ml的注射液連接上灌胃針頭,給模型大鼠灌胃3 ml的活性碳墨水,15 min后腹腔注射10%水合氯醛(0.3 ml/100 g)處死大鼠,用手術剪立即取出整個小腸,浸入5%福爾馬林液以終止蠕動,然后水洗,測量活性炭在小腸的移動距離,以占據幽門到盲腸末的小腸全長的百分率表示。結果見表4。 

            表4 腸墨法推進率%測試結果

            (n=8) 

            組別 腸墨汁推進率%
            空白組 62.96
            束縛組 67.971)
            醋酸組 56.251)
            母分組 67.271)
            綜合因素組 72.561)
             注:與空白組比較:1)表示p<0.05有顯著性差異 
              在本實驗中,束縛組與母分組的大鼠模型推進率均高于空白組,表明應急刺激因素及精神因素對腸蠕動的影響明顯。而醋酸刺激組其推進率沒有空白組高,甚至低于空白組,考慮可能由于腸道化學刺激對腸蠕動能力造成一定的影響。 
            3.5 病理學檢查
                 用水合氯醛把大鼠處死,分離結腸和直腸,使用脫水機和包埋機對大鼠標本進行石碏包埋。
            3.5.1 常規HE染色 在大鼠的直腸和結腸標本完成包埋后,放進常規染色的操作步驟如下:二甲苯兩缸脫蠟各8分鐘;無水乙醇洗脫二甲苯1分鐘×2次;95%→90%→85%酒精各1 min;自來水洗2 min;蘇木精染色1~5 min,自來水洗1 min;1%鹽酸酒精分化20 s,自來水洗1 min;1%稀氨水返藍30 s,自來水洗1 min;伊紅染色20 s~1 min,自來水洗30 s;85%、90%酒精各脫水30 s,95%、100%酒精兩缸脫水各2 min;二甲苯三缸各2 min;中性樹膠封片。
                 光鏡下觀察模型大鼠結腸段和直腸段表面層完整,未發現有潰瘍。結腸與直腸的表面層與粘膜層存在炎性細胞浸潤的情況,主要變化如下:空白組:腸粘膜表面完整,未見糜爛及潰瘍;粘膜上皮細胞及杯狀細胞形態、數量正常;粘膜下層及漿膜層未見水腫及炎細胞浸潤。母分組、束縛組:粘膜表面輕度糜爛,粘膜下層未見水腫,未見炎細胞浸潤。醋酸組:腸粘膜表面輕度糜爛,粘膜下層水腫增厚,并輕度慢性炎癥細胞浸潤。綜合因素組:腸粘膜部分萎縮變薄,腺體減少,粘膜下層輕度水腫。見實驗附圖1~圖5。 

            圖1 空白組HE染色光鏡觀察圖 
             

            圖2 束縛組HE染色光鏡觀察圖 
             

            圖3 醋酸組HE染色光鏡觀察圖 
             

            圖4 母分組HE染色光鏡觀察圖 

             

            圖5 三因素組HE染色光鏡觀察圖 
              結果表明,各組別IBS大鼠模型的的局部組織均無明顯的炎性浸潤,證明本實驗所造腹瀉型IBS動物模型并非炎性反應,符合臨床診斷標準。
            3.5.2 5-HT檢查 按以上的方法將大鼠處死取標本后,脫水,包埋,用全自動免疫組化染色儀進行染色,計量5-HT的染色指數。免疫組化染色指數計算方法:以陽性指數(PI)作為免疫組化反應水平指標。染色強度和染色面積的乘積,即為陽性指數。染色強度:不著色為陰性,記為0分;染成淺黃色為+,記為1分;棕黃色為+ +,記為2分;棕褐色為+ + +,記為3分。染色面積:染色的細胞面積占總細胞面積的百分數。
                 各模型組間5-HT染色比空白組明顯增加,按5-HT陽性指數計數方法,各組的數據見表5。 

            表5 各模型組大鼠5-HT陽性指標平均值

            (n=8) 


               分組
            5-HT陽性指數平均值
              結腸 直腸
            空白組 0.1 0.3
            束縛組 1.11) 1.61)
            醋酸組 1.21) 1.71)
            母分組 0.21) 0.41)
            綜合因素組 0.51) 0.81)
             注:與空白組比較:1)表示p<0.05有顯著性差異 
              由以上結果可見,各單因素組中由應激刺激和腸道化學刺激引起的模型組5-HT明顯增加,而由于精神因素所致的IBS模型改變則不明顯。綜合因素組的5-HT雖然也較空白組有明顯增加,但是僅稍優于母分組,明顯低于束縛組和醋酸組。

            4 討論
                 根據羅馬Ⅲ—IBS的診斷標準,腸道沒有組織性病變是診斷IBS的一個重要內容。常規HE染色是病理檢查中用于炎性細胞檢查的常用方法。所以本實驗選擇HE染色作為模型的一個評定指標。
                 5-HT是一種與胃腸道活動關系密切的腦腸肽,目前已知胃腸道存在五種5-HT受體,這些受體除了對胃腸運動及分泌功能有影響外,對胃腸道感覺功能也有作用,大量研究表明腹瀉型IBS患者的5-HT釋放增加。在以腹瀉為主的IBS患者血清和乙狀結腸黏膜內已觀察到5-HT濃度顯著高于對照組。所以本實驗選擇此指標進行測定,作為IBS動物模型造模是否成功的指標之一。
                 實驗結果表明,綜合因素組無論在大鼠的精神狀況、體重、排便情況、直腸敏感性、腸推進運動還是病理方面的檢測,都與空白組健康的大鼠有明顯的差異,且符合腸易激綜合征的診斷標準,說明綜合因素大鼠造模成功。但是通過比較綜合因素和各單因素動物模型,綜合因素組并沒有表現出明顯的差異。而綜合因素組更加貼近腸易激綜合征臨床上多病因、發病機制復雜的情況,在此方面大大優于單因素動物模型。

            參考文獻
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